iTRAQ标记定量蛋白质组学技术

  iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)2004年开发的同重标签标记的蛋白相对定量技术。该技术采用4种或8种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,然后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量。

技术原理

 iTRAQ标记试剂由三部分组成:报告基团、质量平衡基团和肽反应标记试剂基团,形成4种或8种相对分子质量均等量(145或305)的异位标签。

                                              

                                                                                        iTRAQ标记试剂结构示意图

 报告部分:8标质量数分别为113~121Da(无120),4标质量数为114-117Da,因此iTRAQ最多可同时标记8组样品(客户可按需选择标记个数)。

 肽反应部分:能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接,从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上,几乎可以标记所有蛋白质。

 平衡部分:8标质量数分别为192-184(无185),4标质量数31~24Da,与报告部分相互配合,组成恒定质量数为305或145Da,保证iTRAQ试标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。

 

                                                         

                                                                                                    iTRAQ实验流程图

 iTRAQ试剂是可与氨基(包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基)连接的胺标记同重元素。在一级质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在一级质谱中,不同来源的相同肽段表现为一个峰;在二级质谱中,iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失,信号离子表现为不同质荷比(114~121)的峰,因此根据波峰的高度及面积,可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异;同时,肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。

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技术优势


灵敏度高:可检测出低丰度蛋白;

分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白,小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等;

适用范围广:可以对任何类型的蛋白质进行鉴定,包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等;

高通量:可同时对8个样本进行分析,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析;

结果可靠:定性与定量同步进行,同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息;

自动化程度高:液质连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。


应用领域

科研: 研究特定疾病发生的遗传变异,如单基因遗传病、罕见疾病基因检测等。

农业: 用于品系鉴定、优势性状筛选、群体遗传学分析、亲缘关系分析等

      动植物: 动植物生长发育、抗病、抗逆机制研究以及育种研究。同时可实时更新和补充关联信息的完整性

医学: 阐释疾病的发生发展机制,发现与疾病相关的生物标志物, 以应用于疾病诊断、治疗、预后及用药研究。


平台介绍

高度可靠的结果,快速

  • HRAM 和全扫描能力可以自始至终捕获所有样品数据,从而实现回顾性数据分析而无需再次扫描样品
  • 分辨率高达 140,000 FWHM,可消除同量异序同分异构化合物的干扰,在分析复杂基质中的样品时,提高结果可靠性
  • 全扫描和全离子碎片(AIF)模式质量准确度均优于1ppm,可以确??煽康幕衔锸侗?/span>
  • 12Hz 的快速扫描和多路扫描技术特别适合 UHPLC 应用
  • 快速极性切换可以获得最多信息
  • AIF 和多重解离技术——源内 CID 和 HCD——可以辅助化合物识别
  • 扩展的质量数范围达到 6,000m/z,可以提高对单电荷小分子和生物分子的检测能力
  • 超过四个数量级的扫描动态范围以及飞克级灵敏度,可以在一次扫描中同时检测痕量级和高丰度化合物

更加可靠地应用于药物发现和代谢组学研究

  • 和三重四极杆质谱相当的定量能力不仅可用于定量分析母体化合物和代谢物,而且在识别确定化合物同时提供更高通量
  • 快速 HRAM Orbitrap 技术可以消除干扰,实现高可靠性的代谢物结构识别,并可完成大规模代谢组学和脂类组学样品分析
  • MS 和 MS/MS 模式中均可进行现快速“扫描到扫描”极性切换,可以在单次进样中完成最多的代谢物检测和识别

获得更多蛋白组学信息

  • 与 CID 相比,HCD 可以产生更多碎片和更高质量的 MS/MS 谱图,提高识别能力
  • 高谱图质量和宽动态范围可以对其他仪器无法发现的蛋白质进行识别和定量分析。
  • 定量/定性分析能力使蛋白质组学发现实验轻松转换为目标蛋白质定量分析。

高度特异性的环境和食品安全分析

  • 由于该质谱仪的特异性超过三重四极杆 Q-TOF 或 Q-Trap 的水平,使其成为定量/定性筛查平台的首选
  • 数据依赖的全扫描 MS/MS 能力及 HRAM 数据确保每次识别都具有最高可靠性

为临床研究和法医毒理学的定量确证提供高度可靠性

  • SRM 和 HRAM 的结合轻松为内源性类固醇、滥用药物和镇痛剂的定量确证分析提供了高度可靠性。

特定应用的软件可实现更高通量


仪器型号

Thermo Scientific Q Exactive、AB SCIEX Triple TOFTM fusion plus


样品要求

1.蛋白运输:24小时内可以4℃运输;

2.蛋白长期保存:-20℃;

3.待检测蛋白要求:蛋白量最低300μg,浓度最低要求为1μg/μl,否则同位素无法标记;

4.蛋白提取试剂要求:使用普通的组织、细胞裂解液即可,切忌不要使用二维电泳试剂提??;

      5.直接提供组织或细胞:动物、微生物组织湿重>10mg;植物鲜嫩组织>100mg;细胞量>107个;血液体积>500μl。




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